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DAB染色



免疫组织化学(immunohistochemistry IHC

即应用免疫学基本原理——抗原抗体反应,即抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质),对其进行定位、定性及相对定量的研究。

 

基本原理

它们是用标记的特异性抗体(或抗原)对组织内抗原(或抗体)的分布进行组织和细胞原位检测技术,以其达到对组织或细胞中的未知抗原进行定性,定位或定量的研究。

荧光显色

DAB显色:

ICC:

Tunel

1.样本类型:4%多聚甲醛浸泡过的组织、蜡块、切片

2.样本运输条件:常温运输

 

特点

1.特异性强

免疫学的基本原理决定抗原与抗体之间的结合具有高度特异性,因此,免疫组化从理论上讲也是组织细胞中抗原的特定显示,如角蛋白(keratin)显示上皮成分,LCA显示淋巴细胞成分。只有当组织细胞中存在交叉抗原时,才会出现交叉反应。

2.敏感性高

在应用免疫组化的起始阶段,由于技术上的限制,只有直接法、间接法等敏感性不高的技术,那时的抗体只能稀释几倍、几十倍;现在由于ABC法或SP三步法的出现,使抗体稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍仍可在组织细胞中与抗原结合,这样高敏感性的抗体抗原反应,使免疫组化方法越来越方便地应用于常规病理诊断工作。

3.定位准确、形态与功能相结合

该技术通过抗原抗体反应及呈色反应,可在组织和细胞中进行抗原的准确定位,因而可同时对不同抗原在同一组织或细胞中进行定位观察,这样就可以进行形态与功能相结合的研究,对病理学领域开展深入研究是十分有意义的。

实验流程

 

 

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实验信息(以下信息,请正确填写,以保证实验的正常进行)
  • 一、样本预处理
  • 1.1、样本种属 : 小鼠 大鼠 其他 *
  • 1.2、寄送样本状态 : 骨类组织, 非骨类组织, 蜡块 石蜡切片 冰冻切片 细胞爬片 已染色切片 已拍摄照片 组织芯片 *
  • 1.3、组织类型: *
  • 1.4、组织预处理方式: *
  • 二、切片
  • 2.1、切片方向:

    如图所示:
    平行A面 平行B面 平行C面 随机 参见描述

    注:如样品不规则,请自行描述或标记切片方向,否则,按随机处理,结果不可修改,且由甲方承担。


    切片方向描述: *

  • 2.2、切片厚度: μm/片(大于等于3 μm/片)*
  • 2.3、每个样本切片数量: 片/样本*
  • 2.4、所有组织切片总数量: *
  • 三、染色
  • 3.1、显示方式:

    HE染色, Masson染色, Nissle染色, DAB显色, 荧光单染, 荧光双染, TUNEL凋亡, 其他,

  • 3.2、是否提供抗体或试剂盒

    不提供抗体或试剂盒
    提供

    品牌 货号 抗体名称 数量 推荐工作浓度 备注
    +

  • 四、拍照
  • 4.1、拍照预期视野描述:*

    (补充描述,可以发参考资料到如下邮箱labex@univ-bio.com)

  • 4.2、拍照放大倍数(目镜x物镜): 50X 100X 200X 400X
  • 4.3、合计白光拍照,照片数量: *
  • 4.4、合计荧光单染拍照,照片数量: *
  • 4.5、合计荧光双染拍照,照片数量: *
  • 4.6、全片扫描,照片数量: * (请选择扫描倍数:200倍,还是400倍)
  • 4.7、激光共聚焦拍摄,照片数量: *
  • 4.8、图片是否需要添加比例尺:
  • 4.9、需求图片格式: *
  • 五、样本信息
  • 5.1、样本情况:(如样品数量较多,此处可只填写样本概况,详情可以邮件发送电子版至labex@univ-bio.com)

    是否上传文件: 点击这里上传文件 【注 :目前支持*.xls,*.xlsx,*.docx,*.doc,*.pdf上传】

    样本分组 样本编号 样本数量 备注
    +

  • 5.2、送样方式
    注:
    1,优宁维免费配送一次(客户也可自行邮寄,但须自理邮费)
    2,寄送地址:上海市浦东新区古丹路15号18号楼4楼
    3,联系人及电话:刘美13764270135或者4008-168-068转3。

  • 5.3、样本和试剂是否需要返还*



    返回地址* 联系人及联系方式*
  • 六、其他补充信息
  • 6.1、是否已经进行预实验:

  • 6.2、预实验样品及建议:(注:如果已有成熟的实验条件,不需要预实验,请填写“无”)*

    预实验样品及建议:

  • 6.3、其他补充事项,请说明

  • 7、是否需要加急:
    小于等于5000元订单收取30%加急费用;超过5000元订单收取20%加急费。5个工作日内出结果。(特殊订单除外,一切解释权归优宁维公司所有)
  • 提示:
    一、请核对信息后提交,优宁维工作人员会在提交后24小时内联系您。
    二、免疫组化实验样本冰袋运输,除此之外蛋白检测实验一律在干冰条件下运输。
    三、科研实验不可预知性告知:科学实验研究具有实验结果不可预知性,实验项目可能出现与客户预期不吻合的实验结果,甲方愿意接受实验服务项目中存在的结果不可预知风险。
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DAB染色常规项目举例
样本类型 染色方式 品牌 货号 目标蛋白
人肿瘤 DAB显色 CST 13684 PD-L1
脂肪 DAB显色 abcam 133357 Mac-1 CD11b
血管 DAB显色 abcam 5694 α-smooth muscle Actin
血管 DAB显色 abcam 133357 Mac-1  CD11b
人肝脏 DAB显色 abcam 9391 Angiotensin II Type 1 Receptor 
人肿瘤组织 DAB显色 abcam ab51745 VEGFA
人肿瘤组织 DAB显色 abcam ab178409 PDGF-β
人肿瘤组织 DAB显色 CST 2207 SHH
人肿瘤组织 DAB显色 CST 3868 LC3B
小鼠肝脏 DAB显色 CST 9188 PTEN
小鼠脑肿瘤 DAB显色 Santa SC-25574 SPARC
小鼠肝脏 DAB显色 abcam ab86104 Cdc20
小鼠肝脏 DAB显色 abcam ab28207 PAI1
小鼠肝脏 DAB显色 abcam ab17056 PLK1
大鼠脑 DAB显色 abcam ab2768 Glucocorticoid Receptor
大鼠脑 DAB显色 abcam ab41912 Mineralocorticoid Receptor 
人肝癌组织 DAB显色 abcam ab6002 Histone H3
人肝癌组织 DAB显色 abcam ab21595 Neutrophil Elastase
大鼠股骨组织 DAB显色     igf1,igf2,igflr,akt1,akt2,irs,ghr,agrecan,col1a1,col2a2
小鼠胃肠组织 DAB显色 abcam ab190347 PRPF8
小鼠肿瘤组织 DAB显色 Absin abs115675 CD274
小鼠主动脉弓和颈动脉 DAB显色 Santa sc-1506-R CD31
小鼠主动脉弓和颈动脉 DAB显色 abcam ab31630 CD68
小鼠主动脉弓和颈动脉 DAB显色 abcam ab80508 NOX2
小鼠主动脉弓和颈动脉 DAB显色 abcam ab131364 HAS2
小鼠主动脉弓和颈动脉 DAB显色 Sigma SAB2101015 HAS3
小鼠主动脉弓和颈动脉 DAB显色 abcam ab195946 AMPK
小鼠主动脉弓和颈动脉 DAB显色 Sigma SAB4300848 HAS1
小鼠子宫内膜癌 DAB显色 abcam ab28364 CD31
小鼠子宫内膜癌 DAB显色 Sigma A5228 α-smooth muscle Actin
小鼠脾脏 DAB显色 BD 550278 CD4
小鼠脾脏 DAB显色 BD 550281 CD8
小鼠皮肤 DAB显色 abcam 20663 MITF
小鼠皮肤 DAB显色 Santa sc-7833 TYR
小鼠皮肤 DAB显色 CST 12456 Gsk3-β
小鼠皮肤 DAB显色 Novus NB100-56745 Nur77
小鼠肺 DAB显色 abcam ab32512 CCR3
小鼠肺 DAB显色 abcam ab22048 TLR4
小鼠肺 DAB显色 abcam ab16669 CD3
小鼠肺 DAB显色 R&D MAB6679-SP Meteorin-like/METRNL
人肾癌组织 DAB显色 R&D AF1027-SP B7-H3
人肾癌组织 DAB显色 abcam ab24859 TIE2
人肾癌组织 DAB显色 R&D MAB293-SP VEGF
人肾癌组织 DAB显色 R&D AF7227-SP CD34
小鼠肺 DAB显色 Millipore AB3420-Ⅰ  Surfactant Protein A
小鼠肺 DAB显色 Millipore AB3430 Surfactant Protein B
小鼠肝,肾 DAB显色 R&D MAB4841-SP CD3
大鼠卵巢 DAB显色 CST 5741 Vimentin(D21H3)
狗组织 DAB显色 Santa sc-79 FGF-2
狗组织 DAB显色 Santa sc-53462 VEGF
狗组织 DAB显色 Santa sc-146 TGFβ1
人源细胞裸鼠成瘤 DAB显色 Absin abs118973 phospho-Stat3-γ705

 

免疫组化实验疑难问题解答

常见问题

问题分析及解决方案

对照/标本 无染色

1确认一抗、二抗、三抗及底物等试剂是否有遗漏。

2,确认试剂顺序加入,及孵育时间。

确认是否使用了正确的抗体,检测系统是否和一抗匹配,比如,一抗是兔来源,二抗一定要用抗兔的; 或一抗是小鼠的 IgM ,二抗必须是山羊/兔抗小鼠的 IgM(不是 IgG)。

3检查抗体稀释度及稀释溶液。

检查抗体的有效期和保存条件,尤其是标记了酶或荧光素的抗体,现在大多数试剂公司的抗体均要求在 4~8℃条件下保存,应避免反复冻融,试剂保存时一定要避免与挥发性有机溶剂同放一室,以免降低抗体的效价。

4检查标本的储存条件,最好用已知阳性的标本来同时做阳性对照。检查色原/底物溶液,最简单的检测方法是将一滴标记有酶的抗体加入到制备好的底物溶液中,如果底物发生预期的颜色变化,则可排除底物的因素。需要注意的是,有些底物在制成工作液后应在一定时间内用完,否则会失效。

5检查冲洗液是否和反应试剂匹配,溶液的 pH 值很重要,与过氧化物酶底物匹配的溶液中不应含有叠氮钠。

6检查复染剂和封片剂是否和所使用的色原匹配。

阴性对照没着色而阳性对照弱阳性

1标本的固定方式。不当的固定方式或固定时温度过高,都会影响到所检测的抗原的数量和质量。

2抗原修复方式。由于石蜡切片在制作的过程中固定剂对抗原的封闭作用,必须用抗原热修复或酶消化或两种同时使用的抗原双暴露法,至于使用哪一种方法,应结合标本的具体情况而定。

3抗体的稀释度。孵育的温度/时间,一般试剂生产厂家都会对试剂给出一定的使用范围,但是由于使用者的标本来自各种组织,处理过程也不尽相同,所以应参照使用范围,对所使用的一抗进行梯度测试,找出最佳的使用浓度。

4残留洗液稀释抗体。切片上遗留了过多的冲洗液,当抗体加至切片上时,等于人为地对抗体进行了进一步的稀释。

5抗体流失。孵育时切片是否放置水平,否则会导致抗体流失。

6组织差异。如果阴性对照没有反应,阳性对照反应良好,而标本弱阳性,则可能是由于阳性对照不是同一种组织、或固定方式不同等原因所致。

非特异性 染色

1抗体问题。一分钱一分货!一抗用多克隆抗体容易出现非特异性染色,建议用高纯度,高效价的针对更具特异性抗原决定簇的单克隆抗体来解决。单克隆抗体很贵,不过结果真的很好。尤其是背景非特异性染色不会太深。真是一分价钱一分货。一抗过期也会造成杯具,所以要注意抗体的有效期。

2抗体浓度过高/孵育时间过长。一抗浓度太高也是出现非特异性染色的常见原因。解决的办法就是预实验。每次使用新抗体前应该多做预实验,摸索出最理想的工作浓度,不能简单地按照说明书来用。另一个常见原因就是孵育时间过长。解决的办法就是定时器。加上抗体后,立刻调好定时器,提醒自己及时终止反应,就会避免这个问题。

3DAB染色时间太长/变质。DAB的孵育时间过长,会造成背景非特异性染色。DAB的显色时间不是一成不变的,主要靠自己在显微镜下盯着,一旦出现浅浅的棕色的时候,就要马上冲洗。出现棕色的时间过短,表明抗体浓度过高;出现棕色的时间过长,表明抗体浓度过低。DAB要保存于避光干燥的地方,现用现配,临用前才加入H2O2

4内源性酶和生物素。内源性酶和生物素也会造成非特异性染色,特别是一些内源性酶生物素含量丰富的组织,如肝脏,肾脏,脾脏等。处理的办法有:

灭活碱性磷酸酶:最常用的方法是将左旋咪唑(24 mg/ml 加入底物液中,并保持 pH 值在 7.6~8.2,即能除去大部分内源性碱性磷酸酶,对于仍能干扰染色的酸性磷酸酶,可用 50 mmol/l 的酒石酸抑制。

饱和处理内源性生物素:消除内源性生物素的方法是事先滴加亲和素,以饱和内源性生物素,使之不再有剩余的结合位点。具体方法是在 ABC 法或法染色前将切片浸于 25 ug/ml 亲和素溶液中处理 15 分钟,清洗 15 分钟后即可染色。

5组织变干。一下子染太多片子的时候,容易出现这种情况。解决的办法就是不要贪多嚼不烂。一次少染几张。还有就是试剂充分覆盖组织,超出组织边缘2 mm。然后用PAP笔在组织周围画一个圈圈,把修复液圈在里面。避免修复液流走。圈圈应该距离组织边缘3-4 mm

6浸泡时间过长。切片在缓冲液或修复液里面浸泡过夜,是偷懒的做法。但是有时候也是可以偷一下懒的。秘技就是4°C冰箱。只要把容器放在4°C冰箱里,过夜完全没有问题。

7清洗不充分。清洗一定要充分。PBS液一定要双蒸水新配,用之前再次测PH值。缓冲液用0.05 mol/LTris-HCL0.15 mol/LNaCl即可。如果加一点去垢剂Tween-20就更好了。

8封闭血清是否正确。原则是选择二抗动物的非免疫血清,例如二抗是羊抗兔,就要选择非免疫羊血清。用PBS稀释为3-10%的溶液孵育切片,37°C 10-30分钟。这里不用洗,直接甩掉即可。直接用5%的脱脂奶粉也可以。

 

货号:DAB001

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很高兴您选择优宁维进行科研服务,为了保障我们双方的共同利益,精诚良好的合作,避免产生不必要的责任纠纷,请您认真阅读以下内容并配合我们事宜,若您同意以下内容,请点击同意,进入网站下单界面。

1.为保证数据质量,您需严格按要求准备样本和试剂:

1)血清、血浆、尿液、灌洗液、组织、细胞沉淀、裂解蛋白等,未经过反复冻融,且用量满足实验要求的最低标准。

2)组化实验组织样本,需经过10%中性缓冲福尔马林固定24-72小时后,转移到75%酒精中送样,且保证样品管上标记清晰,不会被酒精渗漏模糊掉字迹。

3)组化实验蜡块和切片样本,常温运输,尽可能使用盒子装蜡块,避免互相之前摩擦影响样本;切片使用切片盒放置,避免玻片之间相关刮创。

4)您必须明确说明提供给乙方的实验材料的安全性,确保无致病性、无传染性,对人、动植物和环境友好安全,以保证实验技术人员的安全。

5)珍贵样本,请您只提供满足实验服务合同的所需量,剩余样本自己保存好以免造成样本的浪费,耽误您的实验进展。

6)甲方任何样本准备过程中的疑问,均可以咨询乙方。或者发邮件至labex@univ-bio.com,或者拨打4008-168-068转3。

2.为保证实验准确性,您需知悉以下内容:

1)非试剂盒验证样本,存在检出率低的风险,客户知晓并同意的情况下,Labex配合开展实验。

2)检出率是在MSD标准曲线范围内的数据,样本内因子含量超出标准品检测范围的情况下:若低于MSD标准曲线范围,则无法检出;若超过标准品检测上限,需实进一步稀释样本优化实验。MSD技术是目前市场上检测范围最宽(横跨4-5log)的多因子检测技术,但蛋白质组几万种蛋白浓度横跨10 log,不能一概而论。

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1)您可自行送样(方式包括快递以及亲送)到我们指定地点,但过程中要保证正确的运输条件,干冰货物或冰袋运输务必保证干冰充足和冰袋低温。并及时通知到我们,方便我们接收。

您还需要准备一份随样单(合同附件所示),标注您的姓名、合同号、样本信息、试剂信息,随快递一起寄送。

若由于您运输条件的原因,导致实验结果问题,相关责任由您承担。

实验室接收样本联系方式,提供寄送咨询: labex@univ-bio.com4008-168-0683

2)若您需要我们协助寄送样本时,我们会收取合理的寄送费用,以我们标准合同上所列收费为准。

4.实验服务合同结束后样本和试剂处置须知:

请您下单前确定实验服务合同结束后,样本处置情况。我们将严格按照合同约定执行。若您选择实验结束后样本,不保留,丢弃,我们会在实验结束后按国家标准自行处置掉相关实验材料。若您需要回寄相关样本,在您支付一定的运输费用后,我们将剩余样本在规定时间内返还给您。若您选择到付,需要保证您的样本是常温和蓝冰运输的,更高要求的运输条件不支持货到付款。若您不确定是否回寄,我们将保持您的样本1个月的时间,如超期,样本我们将自行处置,不在另行通知您。 如果您选择我们回寄样本给您,我们将快递信息邮件告知您,由您跟踪物流信息,并及时确认。如因您个人原因或者第三方物流原因造成的样本邮寄过程中的损耗,我们不承担任何责任。

5.实验服务种实验服务数据:

1) 我们承诺按照《实验样本信息及要求》中的实验方案进行实验并提供客观实验结果,但由于科研实验中存在诸多不确定因素以及未知难度和风险而导致结果的不确定性,不能保证所有的实验进度和实验结果完全达到甲方预期。在排除实验操作问题导致不良结果的前提下,您应尊重客观事实,承担实验结果与预期不一致的结果,包括实验结果是阴性的风险。因此在得不到预期结果的情况下,您仍应支付本次实验服务的全部已发生费用。

2) 实验服务是由专业技术达标的实验人员,遵循科学实验方法和标准操作流程,依照服务合同完成,优宁维保证将客观真实科学严谨的实验结果给到客户,但单次实验不足以阐明某些复杂的科学问题。

3) 您在收到实验数据后,5个工作日内(荧光相关实验3个工作日内)对实验数据质量提质疑,我们有义务解答。若是我们实验过程中的问题,我们承担全部责任;若是您验设计问题,您承担全部责任。我们承诺1个月的数据复核期,欢迎后续咨询。

6.客户知识产权保密协议:

1) 实验服务过程中产生的实验数据的知识产权归您所有,我们承诺不得以任何形式向除甲方以外的第三方提供该实验数据。对于相关的实验技术所有权归我们所有,您不得主张权利。

2) 我们双方共同致力于维护对方的商业机密和技术机密,包括本次合同所签订的文件,您都有义务进行保密。

7.服务承诺

如由于实验客观性需要重复实验、自然灾害、政府行为或其他乙方无法预见、无法避免和无法克服等不可抗力的客观原因造成合同无法按期履行的,我们将及时通知甲方,双方将视情况决定是否继续履行合同。如果由于客观原因造成某些实验项目不能执行的,合同结束时,退回相应款项。

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